Khóa luận: Khái quát về phương pháp nghiêm cứu giống lúa

Chia sẻ chuyên mục Đề Tài Khóa luận: Khái quát về phương pháp nghiêm cứu giống lúa hay nhất năm 2022 cho các bạn học viên ngành đang làm khóa luận tham khảo nhé. Với những bạn chuẩn bị làm bài khóa luận tốt nghiệp thì rất khó để có thể tìm hiểu được một đề tài hay, đặc biệt là các bạn học viên đang chuẩn bị bước vào thời gian lựa chọn đề tài làm khóa luận thì với đề tài Khóa luận: Nghiên cứu đa dạng di truyền của tập đoàn lúa thơm miền Bắc bằng chỉ thị SSR dưới đây chắc hẳn sẽ cho các bạn cái nhìn tổng quát hơn về đề tài này.

2.1. Vật liệu

Vật liệu sử dụng nghiên cứu bao gồm 17 giống lúa chất lượng được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, đang được lưu giữ và bảo tồn tại Ngân hàng gen hạt của Trung tâm Tài Nguyên Thực vật (Bảng 2.6).

15 cặp mồi SSR được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng Invitrogen cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau (Bảng 2.7).

CÓ THỂ BẠN QUAN TÂM ĐẾN DỊCH VỤ:

===>>> Viết Thuê Khóa Luận Tốt Nghiệp Chất Lượng Cao

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số Khóa luận: Khái quát về phương pháp nghiêm cứu giống lúa

Mẫu lá của từng dòng được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến.

• Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60⁰
• Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn.
• Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800µl CTAB buffer và 60 µl SDS 10%.
• Ủ mẫu ở 65⁰C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.
• Bổ sung hỗn hợp CHCl₃-IsoA (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu. Lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới.
• Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCl₃-IsoA (24:1). Thu được dịch chiết chứa ADN.
• Tủa ADN bằng ethanol đã làm lạnh. Để ở -20⁰C trong 1 giờ.
• Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 4⁰
• Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE.
• Độ tinh sạch và nồng độ DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% .

2.2.2. Phản ứng PCR

Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần và hàm lượng cụ thể như sau: Khóa luận: Khái quát về phương pháp nghiêm cứu giống lúa

2.2.3. Điện di sản phẩm PCR

Gel polyacrylamide bao gồm các thành phần sau (bản gel có kích thước 30cm x 12cm):

Dung dịch acrylamide 40%:6ml

Trộn đều hỗn hợp các dung dịch trên và dùng xilanh bơm vào giữa hai tấm kính.

Sau 30 phút gel được polyme hoá hoàn toàn. Lắp ráp máy điện di, tiến hành điện di sản phẩm PCR cùng với thang marker X174 ở điều kiện 150V.

Thời gian điện di khoảng 50-60 phút. Lấy gel ra khỏi kính, nhuộm EtBr nồng độ 0,5% trong 15 phút, rửa lại bằng nước sạch. Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp ảnh gel DigiDoc-It.

2.2.4. Phân tích và xử lý số liệu Khóa luận: Khái quát về phương pháp nghiêm cứu giống lúa

Để xác định quan hệ di truyền giữa các dòng lúa, các kết quả thu được từ quá trình điện di sản phẩm PCR được thành lập dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN.

• Số 1: các allele có xuất hiện băng ADN
• Số 0: các allele không xuất hiện băng ADN
• Số 9: các dòng không xuất hiện băng ADN ở tất cả các allele (mất số liệu) Các số liệu trên được nhập vào phần mềm Exel lần lượt theo từng mồi.

Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau:

PIC =1 – SPi²

Trong đó: P_i là tần số xuất hiện của alen thứ i

Sau đó, số liệu được chuyển sang chương trình NTSYSpc 2.1 để phân tích, tìm ra hệ số tương đồng di truyền (Jaccard) và thành lập cây quan hệ phát sinh.

Tỷ lệ dị hợp tử (H%) của mỗi giống lúa được tính theo công thức:

H%= X M – Y

Trong đó: X là tổng số mồi có xuất hiện nhiều hơn 1 băng ADN/1 locus SSR.

Y là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN.

M là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu.

Tính tỷ lệ số mồi không xuất hiện băng ADN (M%) bằng công thức: M%=_M^Z

Trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng AND.

M là tổng số mồi được sử dụng trong nghiên cứu.

3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến để tách chiết ADN hệ gen từ lá của các giống lúa nghiên cứu. Nguyên lý cơ bản của phương pháp này là sử dụng chất tẩy Cetyl-Trimethyl- Amonium- Bromid (CTAB), chất này có khả năng hòa tan các chất giải phóng ra từ màng tế bào sau khi màng của chúng bị phá vỡ, ADN dễ hòa tan hơn nhiều so với các chất khác. Vì vậy, CTAB đóng vai trò là chất chính trong tách chiết axit nucleic.

ADN tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy các băng ADN tổng số của các giống lúa Tám thơm thu được gọn, sáng đồng đều, không đứt gẫy hay lẫn tạp. Nồng độ ADN cao, đủ tiêu chuẩn để thực hiện các phản ứng PCR và cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Hệ số PIC, số allele và tổng số băng ADN thể hiện trên từng cặp mồi Khóa luận: Khái quát về phương pháp nghiêm cứu giống lúa

Tần số và kích thước các allele trên từng cặp mồi được thể hiện bảng 3.8:

Như vậy, qua kết quả bảng 3.8 cho thấy:

• Số mồi thể hiện 5 allele: 1 mồi (RM153) tương ứng với kích thước (bp): 180, 190, 200, 210, 225.
• Số mồi thể hiện 4 allele: 3 mồi (RM282, RM172, RM515) tương ứng với các kích thước (bp):
• RM282: 85, 95,105, 110.
• RM172: 150, 155, 160, 170.
• RM515: 200, 210, 225, 235.
• Số mồi thể hiện 3 allele: 6 mồi (RM13, RM135, RM143, RM224, RM171, RM245) tương ứng với các kích thước (bp):
• RM13: 120, 135, 155.
• RM135:120, 125, 135.
• RM143: 235, 250, 275.
• RM224: 130, 135, 150.
• RM171: 310, 320, 350.
• RM245:135, 145, 150.
• Số mồi thể hiện 2 allele: 3 mồi (RM30, RM270, RM174, RM224) tương ứng với các kích thước (bp):
• RM30: 125,130.
• RM270: 105, 120.
• RM174: 205, 220.
• Số mồi thể hiện 1 allele: 2 mồi (RM142, RM162) tương ứng với các kích thước (bp):
• RM142: 235.
• RM162: 230.

Qua kết quả thu được ở bảng 3.9, cho thấy: Với 15 cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên có 13 cặp mồi cho kết quả đa hình và 2 cặp mồi cho kết quả đơn hình – chỉ thu được 1 allele (RM142 và RM162). Tổng số allele thu được trên 15 cặp mồi SSR là 42 allele, trung bình 2,8 allele/cặp mồi.

Hệ số PIC trung bình của 15 cặp mồi nghiên cứu là 0,48. Trong đó:

• Giá trị PIC của cặp mồi RM13 là: 0,39.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM30 bằng cặp mồi RM174 là: 0,36.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM282 là: 0,70.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM135 bằng cặp mồi RM143 là: 0,40.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM142 bằng cặp mồi RM162 là: 0.00.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM270 là 0,48.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM153 là cao nhất: 0,74.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM171 là 0,30.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM172 là 0,56.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM224 là 0,38.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM245 là 0,46.
• Giá trị PIC của cặp mồi RM515 là 0,56.

3.3. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) và tỷ lệ dị hợp tử (H) của các giống lúa chất lượng nghiên cứu

Tỷ lệ dị hợp tử (H) và tỷ lệ số liệu khuyết (M) của tập đoàn Tám thơm nghiên cứu dựa trên kết quả phân tích với 15 cặp mồi SSR được trình bày ở bảng 3.10. Khóa luận: Khái quát về phương pháp nghiêm cứu giống lúa

Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy: có 3 giống khuyết số liệu ở một mồi duy nhất và cùng tỉ lệ là 6,67% là T4 (Tám thơm Hải Dương), T11 (Tám xoan Vĩnh Phúc), T12 (Tám xoan Hải Hậu). 14 giống còn lại không bị khuyết số liệu. Tỉ lệ khuyết số liệu trung bình của 17 giống là 1,17%; không có giống nào có tỷ lệ khuyết số liệu lớn hơn 15%. Như vậy, cả 17 giống nghiên cứu đều có ý nghĩa phân tích thống kê.

Tỷ lệ dị hợp tử (H) cao nhất ở giống lúa T12 (Tám xoan Hải Hậu) là 7,14%. Có 3 giống (Tám trắng Vĩnh Phúc), T13 (Tám thơm ấp bẹ), T16 (Tám Xuân Hồng) có tỷ lệ dị hợp là 6,67%. Còn lại 13 giống có tỷ lệ dị hợp tử 0% có nghĩa là các giống này đều đồng hợp trong phạm vi 15 mồi nghiên cứu (chỉ có một băng ADN duy nhất/mồi). Tỷ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn khá thấp là 1,60%.

3.4. Kết quả phân tích đa hình và mối quan hệ di truyền của các giống lúa chất lượng nghiên cứu

Số liệu thu được từ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 15 cặp mồi SSR với tập đoàn 17 giống lúa chất lượng nghiên cứu được thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền (Bảng 3.4) và sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa chất lượng (hình 3.5).

Qua kết quả thu được ở bảng 3.11 và hình 3.6 cho thấy: Hệ số tương đồng di truyền của 17 giống lúa Tám nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,08 (T4 – Tám thơm Hải Dương và T16 – Tám Xuân Hồng) đến 0,86 (T9 – Tám xoan Bắc Ninh và T11 – Tám xoan Vĩnh Phúc)

Dựa vào sơ đồ mối quan hệ di truyền của 17 giống lúa, ở mức tương đồng di truyền 36%, 17 mẫu giống lúa nghiên cứu được chia thành 3 nhóm:

Nhóm I: Có 12 giống lúa bao gồm các giống T1 (Tám tức Tây Bắc), T12 (Tám xoan Hải Hậu), T5 (Tám thơm Thái Bình), T8 (Tám xoan có râu Hải Dương), T7 (Tám đứng Hải Dương), T9 (Tám xoan Bắc Ninh), T11 (Tám xoan Vĩnh Phúc), T16 (Tám Xuân Hồng), T14 (Tám Xuân Đài), T15 (Tám tiêu), T13 (Tám thơm ấp bẹ), T17 (Tám Nghĩa Hồng).

Xét ở mức tương đồng di truyền 48%: 12 giống trong nhóm I được chia làm 3 nhóm phụ:

• Nhóm I.1 gồm có 3 giống lúa: T1 (Tám tức Tây Bắc), T12 (Tám xoan Hải Hậu), T116 (Tám Xuân Hồng). Hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,63 (T1 và T12), và (T12 và T16). Hệ số di truyền tương đồng thấp nhất (giữa giống T1 và giống T16) là 0,56.
• Nhóm I.2 gồm có 5 giống lúa: T5 (Tám thơm Thái Bình), T7 (Tám đứng Hải Dương), T8 (Tám xoăn có râu Hải Dương), T9 (Tám xoan Bắc Ninh) và T11 (Tám xoan Vĩnh Phúc). Trong đó hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,44 đến 0,86. T9 và T11 có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,86.
• Nhóm I.3 gồm 4 giống lúa: T13 (Tám thơm ấp bẹ), T17(Tám Nghĩa Hồng), T14 (Tám Xuân Đài) và T15 (Tám tiêu). Trong đó có hệ số tương đồng cao nhất là 0,75 (giữa T13 và T15). Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống còn lại dao động từ 0,47 đến 0,74.

Nhóm II: Gồm giống lúa T6 (Tám tròn Hải Dương) và T10 (Tám nghệ hạt đỏ). Hệ số tương đồng di truyền giữa 2 giống trong nhóm này là 0,47.

Nhóm III: Gồm các giống lúa T2 (Tám trắng Vĩnh Phúc), T3 (Tám đen Hà Đông), T4 (Tám thơm Hải Dương). Nhóm này có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,37- 0,53. T2 và T4 có hệ số tương đồng di truyền cao nhất.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận Khóa luận: Khái quát về phương pháp nghiêm cứu giống lúa

Tập đoàn lúa Tám thơm bản địa miền Bắc nghiên cứu rất đa dạng về các thành phẩn allele. Kết quả phân tích với 15 cặp mồi SSR thu được tổng số 42 loại allele, trung bình 2,8 allele/cặp mồi. Hệ số PIC trung bình của 15 cặp mồi nghiên cứu là 0,48. Hệ số PIC đạt giá trị cao nhất (0,74) ở cặp mồi RM153 với 5 allele thể hiện. Các giống lúa nghiên cứu có độ thuần di truyền rất cao (tỉ lệ dị hợp tử trung bình của cả tập đoàn là 1,60 %).

Tập đoàn 17 giống lúa chất lượng nghiên cứu rất đa dạng, có hệ số tương đồng di truyền giữa các giống dao động từ 0,08 đến 0,82. Xét ở mức tương đồng di truyền 36%: 17 mẫu giống lúa nghiên cứu được chia thành 3 nhóm:

• Nhóm I: Gồm có 12 giống hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng từ 0,22 – 0,86 và được chia làm 3 nhóm phụ.
• Nhóm II: Gồm có 2 giống hệ số tương đồng di truyền là 0,47.
• Nhóm III: Gồm có 3 giống có hệ số tương đông từ 0,37- 0,53.

Các kết quả thu được rất hữu ích trong việc xác định nguồn gen phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa chất lượng của Việt Nam.

2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu xác định các allele đặc trưng, allele hiếm để nhận dạng chính xác các nguồn gen lúa Tám thơm ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chất lượng ở mức phân tử. Khóa luận: Khái quát về phương pháp nghiêm cứu giống lúa

XEM THÊM NỘI DUNG TIẾP THEO TẠI ĐÂY

===>>> Khóa luận: Nghiên cứu đa dạng di truyền của tập đoàn Lúa Thơm